Método: Células competentes y transformación

Descripción

La transformación es una método por el cual un ADN ajeno se introduce en una célula generalmente bacteriana. La transformación de bacterias tiene una gran relevancia no solo en el campo de la microbiología, sino también como técnica de almacenamiento y replicación de secuencias de ADN o plásmidos. Por lo general, la mayoría de los plásmidos (incluso los diseñados para células de mamíferos) tienen un origen de replicación bacteriano y un gen de resistencia a antibióticos para usar como un marcador de selección.

Para fines de investigación o aplicaciones industriales se han realizado muchas modificaciones genéticas para crear cepas que pueden transformarse fácilmente y que ayudarán a mantener el plásmido sin reordenamiento del ADN del plásmido. Además, se han descubierto tratamientos específicos que aumentan la eficiencia de la transformación y hacen que las bacterias sean más susceptibles a la transformación química o eléctrica, generando lo que comúnmente se conoce como “células competentes”.

Materiales

• Tubos de vidrio para cultivo estériles
• Cepa de bacterias para generar sus células competentes, generalmente E.coli DH5α
• Medio rico LB (medio rico Luria-Bertani)
• Tubos para centrifugar 50-100 mL
• Balanza granataria
• Balanza analítica
• Matraces Erlenmeyer 250 mL (u otro matraz para de agitación de 250 ml)
• Espectrómetro para leer a 600 nm
• Tubos de 1.5mL
• Cajas petri de cultivo estériles
• Baño maria a 37 °C
• Vortex
• Asa bacteriológica
• Mechero
• Campana de cultivo (Nivel de bioseguridad I)
• Incubadora para microbiología
• Probeta
• Papel aluminio
• Cinta testigo
• Autoclave

Reactivos

• CaCl₂
• Peptona
• Triptona
• Extracto de levadura
• Agua ultra pura
• NaOH
• Hielo
• Agar
• Antibiótico de selección

Procedimiento de las células químicamente competentes

1. Realice un subcultivo bacteriano durante la noche 0.5 mL/50 mL en un matraz con LB.
2. Cresca a 0.5 – 0.7 A600.
3. Centrifugar 8000 rpm 5 min en tubos para centrífuga estériles.
4. Resuspender en 5 ml de CaCl₂ 30 mM frío y resuspenda en un vortex . NOTA: las células se pueden dejar en hielo en este punto de 4-8 horas.
5. Posteriormente, distribuya 1.5 mL en tres tubos estériles de 1.5mL
6. Centrifugue durante 30 segundos en una microcentrífuga.
7. Resuspender cada gránulo en 0,5 ml de CaCl₂ 30 mM helado, sin agitación. NOTA: agite el tubo suavemente con su dedo para hacer esto.
8. Coloque alícuotas de 50 µL en tubos estériles de 1.5 mL en glicerol bacteriano (gliceroles)

Transformación

1. Agregue ADN al tubo del paso 8, usualmente 1 µL de una extracción de ADN plasmídico (miniprep), o de una ligación, o una dilución apropiada de ADN purificada. NOTA: entre 10-50 ng de ADN se obtienen más células transformadas 
2. Incube en hielo 30 min.
3. Después de un choque térmico a 42 °C durante 30 segundos, luego enfríe de nuevo en hielo 5 min.
4. Crezca las células en un tubo de 1.5 mL con 1 mL de LB durante 1 hora a 37 °C
5. Posteriormente plaquear sobre las cajas selectivas que contienen medio LB-agar y el antibiótico de su selección.
6. Deje crecer 12 horas y observe el crecimiento de colonias. NOTA: si deja más tiempo en ampicilina observará células satélites, células No transformadas alrededor de las transformadas porque están siendo protegidas indirectamente por la actividad de la ß-lactamasa.
7. Tome una asa bacteriológica y propague su cepa transformada en una caja selectiva con medio LB-agar
8. Analice su cepa mediante enzimas de restricción o PCR
9. ¡Sea feliz!

LB medio rico

NOTA 1: Combine los reactivos y agite hasta que los solutos se hayan disuelto. Ajuste el pH a 7.0 con NaOH 5 N (~ 0.2 mL). Posteriormente, ajuste el volumen final de la disolución a 1 L con _(dd)H₂O. Esterilice en autoclave durante 20 min a 15 psi (1.05 kg/cm²) en el ciclo de líquido. Coloque su probeta tapada con aluminio para rellenar las cajas petri

NOTA 2: Coloque el antibiótico a la concentración deseada cuando el agar esté tibio.